革兰氏染色的差异源于细菌细胞壁结构和化学成分的不同。

革兰氏阳性菌（G⁺）：细胞壁厚，富含肽聚糖和磷壁酸，结构致密。在经过乙醇或丙酮脱色时，肽聚糖层脱水收缩，使得结晶紫-碘复合物被牢牢锁在细胞壁内，不易被洗脱，因此最终呈现紫色或蓝色。

革兰氏阴性菌（G⁻）：细胞壁薄，肽聚糖层较薄，但外膜含有丰富的脂多糖和脂质。脱色剂能溶解外膜的脂质，破坏细胞壁完整性，形成孔隙，从而使结晶紫-碘复合物极易被洗脱。当复染剂沙黄或品红加入后，细胞便被染成红色或粉色。

1、菌种：待测细菌的新鲜培养物（通常为18-24小时菌龄）。

2、载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、显微镜。

3、四种关键试剂（按使用顺序）：

初染剂：结晶紫（Crystal Violet）

媒染剂：路哥氏碘液（Lugol's Iodine）

脱色剂：95%乙醇（Ethanol）或丙酮-乙醇混合液

复染剂：沙黄（Safranin）或稀释石炭酸品红（Carbol Fuchsin）

第一步：涂片、固定

1、制备涂片：取一滴无菌水或生理盐水于载玻片中央，用无菌接种环挑取少量菌落，均匀涂布成直径约1厘米的薄层膜。

2、风干：在空气中自然风干。

3、热固定：将涂有菌膜的一面朝上，快速通过酒精灯火焰2-3次。此步骤旨在杀死细菌并使其牢固附着在玻片上，但需避免过度加热导致细胞形态改变。

第二步：结晶紫初染

1、用结晶紫染液覆盖菌膜，染色1分钟。

2、用缓流自来水轻轻冲洗，洗去多余染液，甩干玻片上多余水分。

第三步：碘液媒染

1、用路哥氏碘液覆盖菌膜，染色1分钟。

2、碘液作为媒染剂，能与结晶紫形成分子量更大、溶解度更低的结晶紫-碘复合物（CV-I Complex）。

3、再次用缓流自来水轻轻冲洗，甩干。

第四步：乙醇脱色（最关键的一步）

1、将载玻片倾斜，用95%乙醇滴流冲洗涂片，直至流下的乙醇几乎无色（此过程通常仅需5-15秒，具体时间需经验判断）。

2、立即用缓流水轻轻冲洗，终止脱色。

第五步：沙黄复染

1、用沙黄染液覆盖菌膜，复染30秒至1分钟。

2、用缓流自来水冲洗干净，用吸水纸轻轻吸干或自然风干。

镜检：待玻片完全干燥后，在油镜下（100×物镜）观察。紫色为革兰氏阳性菌（G⁺），红色为革兰氏阴性菌（G⁻）。

Q1：脱色环节如何把握？时间太短或太长会怎样？

问题：脱色是革兰氏染色中最需要经验的一步，难以精确计时。

影响：

脱色不足：如果乙醇作用时间太短，所有细菌（包括G⁻菌）的CV-I复合物都未被充分洗脱，在复染后G⁻菌也可能呈现紫色，导致假阳性结果。

脱色过度：如果乙醇作用时间太长，G⁺菌细胞壁中的CV-I复合物也会被部分或全部洗脱，随后被染成红色，导致假阴性结果。

解决方案：采用滴流法而非浸泡法，并密切观察流出液的颜色，当其从深紫色变为淡紫色或无色时立即停止。新手可用已知的G⁺（如金黄色葡萄球菌）和G⁻（如大肠杆菌）菌株做对照练习。

Q2：为什么会出现“革兰氏可变性”或结果不明确？

菌龄问题：使用老龄细菌（培养超过24-48小时）时，G⁺菌的细胞壁可能受损，肽聚糖降解，导致脱色时染料泄漏而呈红色或紫色不均匀（革兰氏可变性）。

涂片过厚：菌膜过厚会使脱色剂无法均匀作用，内部细菌脱色不充分，可能导致G⁻菌核心呈紫色，外围呈红色。

解决方案：始终使用18-24小时内的新鲜培养物制备薄而均匀的涂片。

Q3：染色结果中背景有沉淀或杂质怎么办？

问题：视野中有大量颗粒状沉淀，影响观察。

原因：通常是染液沉淀或涂片清洗不彻底所致。

解决方案：确保所有染液经过过滤且无沉淀；每一步冲洗后应充分甩干玻片上的积水，再进行下一步操作。

Q4：热固定时需要注意什么？

问题：固定不牢或细胞变形。

影响：固定不牢会导致菌体在染色冲洗过程中被冲走；过度加热会使细胞扭曲、破裂，影响形态观察和染色结果。

解决方案：将玻片在火焰上以不烫手背的温度快速通过2-3次即可。

Q5：镜检时视野中找不到细菌或细菌数量很少？

原因：可能因涂片时菌量取得太少，或冲洗步骤水流过猛将菌膜冲掉。

解决方案：挑取适量菌苔，确保涂片有足够的细菌密度；所有冲洗步骤必须使用缓流的水，并让水从玻片一端流下，避免直接冲刷菌膜区域。