以下是其详细的工作原理，分为三个核心步骤：
1. 样品分区
这是数字PCR最核心的环节。
目的：将一个标准的PCR反应体系（包含待检测的DNA模板、引物、荧光探针等）随机分配到成千上万个独立、微小的反应单元中。
方式：
（1）微滴式：通过微流控或油包水技术，将样品生成数万个甚至数百万个纳升级别的微滴（如Bio-Rad的QX系列）。
（2）芯片式：将样品分配到物理分隔的微孔芯片中（如Thermo Fisher的QuantStudio系列）。
（3）物理分割：使用高密度的微流控芯片进行物理隔离。
（4）关键结果：分区后，每个微反应单元要么含有0个目标分子，要么含有1个（或极少数情况多个）目标分子。这个过程遵循泊松分布的统计学原理。
2. PCR扩增与终点检测
分区完成后，这些反应单元（微滴或微孔）会在常规的热循环仪上进行PCR扩增。
扩增：每个微反应单元独立进行PCR反应。如果某个单元内包含至少一个目标DNA分子，扩增后该单元的荧光信号会显著增强（阳性）；如果单元内没有目标分子，则没有荧光信号（阴性）。
检测：扩增结束后，仪器会逐个读取每个反应单元的荧光信号。这个过程就像数数一样，记录下哪些孔/微滴亮了（阳性，1），哪些没亮（阴性，0）。
3. 绝对定量分析
这是将荧光信号转化为精确数据的步骤。
计数：仪器统计阳性单元的数量（即发生了扩增的单元）和阴性单元的数量（未发生扩增的单元）。
泊松校正：理论上，我们希望在分区时每个单元最多只有一个分子。但由于随机分布，有可能出现两个或多个目标分子进入同一个单元的情况。例如，如果10000个单元中有400个是阳性，你不能简单地认为只有400个分子，因为那400个阳性单元中可能有些单元含有多个分子。因此，需要利用泊松分布公式进行校正：通过阳性单元的比例（即阳性单元数/总有效单元数），计算出样本中目标DNA分子的绝对起始拷贝数或浓度。
结果输出：直接输出拷贝数/µL（微升）或copies/reaction（拷贝/反应），无需依赖标准曲线。
与传统qPCR（实时荧光定量PCR）的对比：
| 特性 | 数字PCR （dPCR） | 实时荧光定量PCR （qPCR） |
| 原理 | 无限稀释 + 终点计数 | 扩增曲线 + Ct值（循环阈值） |
| 定量方式 | 绝对定量（直接计数） | 相对定量（依赖标准曲线） |
| 依赖标准品 | 不需要 | 必须依赖标准品或内参基因 |
| 灵敏度 | 极高（可检测稀有突变，1/100000） | 较高 |
| 主要优势 | 不受扩增效率影响，高精度，抗抑制能力强 | 动态范围宽，成本较低，操作简便 |
