PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量。模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要。模板处理方法的选择及操作人员的基 本技能，决定分离模板核酸(DNA或RNA)的质和量及PCR的成败。而提高模板核酸质量的 关键是除去杂质(蛋白质、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的产量。
传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用。但近几年来也发展了些 简便实用较为有效的标本消化处理方法。亦可满足PCR实验的要求。采用哪种方法消化 处理标本，视PCR实验的目的(是科研还是检测)及环境条件而定。
模板核酸的提取制备方法:
一、蛋白酶K消化裂解法：适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳。如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等。
1、试剂配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中。
2、提取方法:
有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等。
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜。加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增。 如杂质较多，还可经酚:抽提后，即可用于PCR反应。此法蛋白质及其它杂质消除 *，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性。但操作繁复，技术要求高。
二、直接裂解法: 标本(组织细胞，分泌物)加PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐温-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原体，裂解细胞。然后12000r/min离心5～10min，取上清20～30ul用于PCR扩增。血清标本可 直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBV DNA.
PCR实验中的核酸提取方法（上）
2025-11-21 来源：网络
