质谱仪的校准对于精确的 m/z 测量至关重要。校准的定义是“将已知精度的测量标准或仪器与另一标准或仪器进行比较，通过调整消除偏差”。本文中的校准一词用于表示质量轴校准。其他校准（如电源电压）不在本章讨论范围之内。质量轴校准需要在整个质量范围内均匀分布一系列离子。校准完成后，可以在校准范围内的任何质量范围获取数据。因此，在较大的质量范围内进行校准是明智之举。手动、半自动和自动校准要求在程序运行时以稳定的速率将校准液（校准溶液）引入质谱仪。校准溶液通过注射泵或连接到 LC 泵的注射器直接（注入）到质谱仪中。
建议至少每三个月校准一次质谱仪，并且大约每周检查一次校准情况。校准的频率取决于所需的质量精度。例如，在对肽和蛋白质进行精确质量测量时，应每天校准仪器。不过，小分子定量分析所需的校准频率较低。
校准参数
质量分析仪应定期注入校准溶液进行校准。一般使用电喷雾离子源 (ESI)。该溶液产生的离子（已知精确质量）应涵盖整个仪器的质量范围，或至少涵盖将用于后续分析的质量范围。
其中校准所涉及的参数称为校准参数。是指：其值不随实验类型而变化的仪器参数，例如峰宽、峰形、质量分布以及分辨率与灵敏度等。
峰宽取决于质量分辨率。在大多数小分子定性/定量应用中，1 个质量单位（即1 Da)的分辨率足以区分离子。单位分辨率的典型定义是:半峰高处的峰宽约为 0.6 至 0.8 质量单位。典型台式 LC-MS 的离子轮廓扫描带宽约为 1 个质量单位。
峰形和轮廓扫描。如图 2 所示，在典型的台式 LC-MS 中，丰度测量是以 0.10 m/z 的增量进行采集。当这些数据显示在质谱中时，可显示一条单线。高度和位置由轮廓扫描得出。
质量分配。使用特定的质谱校准物进行。校准物应是特性良好的参考物质。这些物质的认证和处理应记录在案。LC-MS 定性分析始终使用参比物质，而定量分析则结合使用参比物质和实际分析物标准品作为校准物。
分辨率与灵敏度。质量分辨率是离子强度和峰宽之间的折衷。一般来说，分辨率越高，离子强度越低。
校准方法
对于市场上最新的 LC-MS 来说，软件包中包含了一个自动程序，用于在 ESI 模式下进行调整和校准。不过，较旧的仪器和/或非常特殊的应用仍需要手动或半自动程序来优化影响离子检测的参数。在 LC-MS 仪器中，质谱仪的校准分为三个步骤：
离子源和传输优化
质谱校准
微调（最大限度地检测一个或多个特定离子）。
离子源和传输优化。在这一步骤中，以 5 μL/min 左右的稳定速率注入校准溶液，持续数分钟，从而在 ESI 模式下对质谱仪的一个或多个特定离子进行大致调整。引入校准溶液化合物的最佳方法是使用大容量莱茵进样环（50 或 100 μL）或注射泵（如汉密尔顿注射泵）：使用大容量注射回路时，溶剂输送系统应设置为以5μL/min 左右的速度将 50 : 50 的乙腈/水或 50 : 50 的甲醇/水通过注射器注入离子源。注射 50 μL 校准溶液将持续至少 10 分钟。使用输液泵时，应将校准溶液注入注射泵，然后用熔融石英管或 peek 管连接至 ESI 喷针。
选择用于优化的离子应位于校准范围的中间或特定的相关区域（例如，咖啡因的 m/z = 195 或 PPG 校准溶液的 m/z = 906.7）。在使用自动调整程序来证明进入质谱仪的离子传输达到最佳状态之前，应手动调整 ESI 源喷雾器，以建立进入质谱仪的稳定离子喷雾，并确保检测到足够的离子来校准质谱仪。
调整程度因型号而异，并取决于源的几何形状。一般来说，喷雾偏离入口轴线的离子源（如正交喷雾和 Z 向喷雾）需要的调整较少。对于同轴喷雾源，为避免污染仪器光学元件，必须检查喷雾源是否直接喷射到仪器孔口。轴上离子源通常有一个侧窗，可以很好地观察喷射轨迹。在这两种情况下，喷雾器都应始终小幅度移动，直到达到所关注离子的最高信噪比的最佳位置。离子源参数（如雾化器气体、透镜电压）可自动、半自动或手动优化。
质谱校准。第二步，使用校准溶液校准 ESI 模式下的质谱仪。所有质量分析仪都必须校准。例如，三重四极杆质谱仪 (QQQ) 的 Q1 和 Q3 都要进行校准。以下是校准过程：
01
获取校准溶液的质谱图（校准文件），并与存储在参考文件中的校准溶液质谱峰预期质量表进行比对。
02
将参照文件中的每个质谱峰与校准文件中的相应质谱峰进行匹配。
03
校准文件中相应的匹配质谱峰即为校准点。
04
通过校准点拟合校准曲线。
05
计算每个校准点与曲线的垂直距离。该距离代表校准后的残差。同时计算残差的标准偏差。这个数字是校准精度的最佳单一指标。
06
同时计算残差的标准偏差。这个数字是校准精度的最佳单一指标。
自动校准
在开始自动校准之前，需要设置一些峰值匹配参数。这些参数决定了获取的数据必须在哪个范围内，软件才能识别校准质量并成功校准。这些参数包括：
01
质谱峰搜索范围。这是校准软件用于搜索最强质谱峰的窗口。增大该窗口会增加质谱峰匹配错误的几率。必须确保在质谱峰搜索范围内找到正确的质谱峰；否则，校准可能会出现偏差。如果定位到不正确的峰，则应调整搜索质谱峰范围，以便只定位到正确的离子。
02
质谱峰阈值。校准程序中将不使用所获质谱中低于强度阈值（通常以质谱中最强峰的百分比来衡量）的所有峰。
03
质谱峰最大标准偏差或预测质量与实际质量之间的最大差值。在校准过程中，每对匹配峰都会测量获取的校准文件中的测量质量与参考文件中的真实质量之间的差值。如果该值超过设定值，校准将失败。降低标准偏差值可获得更严格的限制，而增加标准偏差则意味着更容易满足要求，但这可能会导致质谱峰匹配不正确。
04
峰宽。这是一个用于设置分辨率的指标，通常规定为最大强度的 50%。
如果获取的质谱图与参考质谱图相似，且所有预期质谱峰都通过了上述标准，则校准可以接受。如果仪器以前从未校准过或以前的校准文件丢失，则必须使用更详细的校准程序。该校准程序要求从最低质量离子开始定位已知质谱峰。找到质谱峰后，将为离子的精确质量分配一个数模转换值。
一旦对仪器进行了全面校准，下次使用仪器时并不一定需要重复全面校准过程。可以通过注入校准溶液并将所有质谱峰匹配参数设置为全面校准时使用的值来执行校准验证，而不是全面校准。如果预测质量和实际质量之间的差异不大，则原始质量校准曲线仍然有效。无论仪器型号/品牌如何，在自动校准结束时都可以获得一份最终报告，其中显示校准溶液的预测精确质量、质谱中每个峰的实际质量、这两个质量之间的差值（校准精度），在许多情况下还会显示实验中指定的所有离子的强度和峰宽。
微调。第三步，对一个或多个特定离子的检测进行优化，以便在 ESI 或 APCI 模式下，利用相关分析物的标准（如果有的话）对质谱进行调谐。可以选择相关分析物的质量电荷比，或者在没有分析物标准的情况下，选择校准溶液中最接近相关离子质量电荷比的离子。
