（1） 退火温度不合适。以2℃为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（2） DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（3） PCR循环数不足。增加反应循环数。

（4） 引物量不足。增加体系中引物含量。

（5） 延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

（6） 变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

（7） DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净