一、实验目的
通过对好气性自生固氮菌的计数，了解稀释培养计数（MPN）的原理和方法。
二、实验原理
最大或然数(most probable number，MPN)计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度。本法特别适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等。见附表23-1）的数量和检测污水、牛奶及其他食品中特殊微生物类群（如大肠菌群）的数量，缺点是只适于进行特殊生理类群的测定，结果也较粗放，只有在因某种原因不能使用平板计数时才采用。
MPN计数是将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如lm1）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数”理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。具体地说，菌液经多次10倍稀释后，一定量菌液中细菌可以极少或无菌，然后每个稀释度取3―5次重复接种于适宜的液体培养基中。培养后，将有菌液生长的最后3个稀释度（即临界级数）中出现细菌生长的管数作为数量指标，由最大或然数表（见附录九）上查出近似值，再乘以数量指标第一位数的稀释倍数，即为原菌液中的含菌数。
如某一细菌在稀释法中的生长情况如下；
稀释度 lO-3 10-4 10-5 lO-6 10-7 10-8
重复数 5 5 5 5 5 5
出现生长的管数 5 5 5 4 1 0
根据以上结果，在接种lO-3―10-5稀释液的试管中5个重复都有生长，在接种lO-6稀释液的试管中有4个重复生长，在接种10-7稀释液的试管中只有1个生长，而接种10-8稀释液的试管全无生长。由此可得出其数量指标为“541”，查最大或然数表得近似值17，然后乘以第一位数的稀释倍数（10-5的稀释倍数为100 000）。那么，1ml原菌液中的活菌数＝17×100 000 = 17×105。即每毫升原菌液含活菌数为l700000个。
在确定数量指标时，不管重复次数如何，都是3位数字，第一位数字必须是所有试管都生长微生物的某一稀释度的培养试管，后两位数字依次为以下两个稀释度的生长管数，如果再往下的稀释仍有生长管数，则可将此数加到前面相邻的第三位数上即可。
如某一微生物生理群稀释培养记录为：
稀释度 lO-1 10-2 10-3 lO-4 10-5 10-6
重复数 4 4 4 4 4 4
出现生长的管数 4 4 3 2 1 0
以上情况，可将最后一个数字加到前一个数字上，即数量指标为“433”，查表得近似值为30，则每毫升原菌液中含活菌30×102个。按照重复次数的不同，最大或然数表又分为三管最大或然数表、四管最大或然数表和五管最大或然数表。
应用MPN计数，应注意两点，一是菌液稀释度的选择要合适，其原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长。对土壤样品而言，分析每个生理群的微生物需5―7个连续稀释液分别接种，微生物类群不同，其起始稀释度不同(见附表1)；二是每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般2―5个重复，个别也有采用2个重复的，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确。不同的重复次数应按其相应的最大或然数表计算结果。
若要求出土样中每克干土所含的活菌数，则要将前述两例中所得的每毫升菌数除以干土在土样中所占的质量分数（烘干后的土样质量／原始土样的质量）。
计算式为：
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三、实验器材
1. 土壤样品：肥沃菜园土
2. 培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养液(附录三、15)22管(每管装5ml，加1cm×4.5cm滤纸l条)
3. 器材：90ml无菌水（装入250 ml三角瓶中，并装有15―20个玻璃珠）、9ml无菌水、lml刻度无菌吸管、试管架、记号笔。
四、实验方法
1．称取10克土样，放入90ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，然后按十倍稀释法将供试土样制成10-1―10-6的土壤稀释液。
2．将22支装有Ashby无氮培养液的试管按纵4横5的方阵排列于试管架上，第一纵列的4支试管上标以10-2，第二纵列的4支试管上标以10-3……第五纵列的4支管上际以10-6（即采用5个稀释度，4个重复），另外2支试管留作对照。
3． 用lml无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6的土壤稀释液各lml放入编号10-6的4支试管中，再吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的4支试管中，同法吸取10-4、10-3、10-2稀释液各lml放入各自对应编号的试管中。对照管不加稀释液。
4．将所有试管置28―30℃培养7天后观察结果。
5．精确称取3份10克稀释用土，放入称量瓶中，置105-110℃烘2h后放入干燥器中，至恒重后称重，然后计算干土在土样中所占的质量份数。
五、实验作业：
培养7天后，取出试管，检查实验结果。
凡有固氮菌生长的试管，则培养液与滤纸接触处有黑褐色或粘液状菌膜，即为阳性，否则为阴性。对照管应为阴性。依次检查每管生长情况，将结果填入下表，计算每克干土所含的活菌数。
土壤稀释度 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | ||
重复次数 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | ||
固氮菌生长管数 | | | | | | ||
数量指标 | | | | | | ||
干土的质量分数 | | 菌数近视值 | | ||||
每克干土固氮菌数 | 个/克干土 | ||||||
附表23-1 几种主要微生物生理群MPN计数法一览表
微生物生理群 | 培养基 | 常用稀释度 | 常用重复次数 | 培养时 间 (天) | 主 要 检 查 方 法 |
氨化细菌 | 蛋白胨氨化培养基 | 0-6―10-9 | 4 | 7 | 根据培养液加奈氏试剂后是否出现棕色或褐色，确定是否产生氨。 |
亚硝酸细菌 | 铵盐培养基 | 0-2―10-7 | 3 | 14 | 根据培养液加格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ的反应，出现绛红色证明有NO-2生成；或在培养中加锌碘淀粉试剂及体积比值为20%的H2SO4，若出现蓝色，证明有NO-3生成。 |
硝酸细菌 | 亚硝酸盐培养基 | 0-2―10-6 | 3 | 14 | 根据培养液加入浓硫酸及二苯胺试剂后，是否出现蓝色，确定是否有NO-3生成。 |
反硝化细菌 | 反硝化细菌培养基 | 0-4―10-8 | 3 | 14 | 根据杜氏小管有无气体，确定有无N2生成；利用格利斯试剂Ⅰ及Ⅱ和二苯胺试剂、浓硫酸检测有无NO-2生成及有无NH3存在，判断反硝化作用进行情况。 |
好气性自生固氮菌 | 阿须贝无氮培养基 | 0-2―10-6 | 3 | 7-14 | 根据培养液表面与滤纸接触处有无褐色或粘液状菌膜生成，判断有无好气性自生固氮菌生长。 |
好气性 纤维素分解菌 | 赫奇逊噬纤维培养基 | 0-1―10-5 | 3 | 14 | 根据各试管中滤纸条上有无黄色或桔黄色菌斑出现及滤纸断裂状况，确定有无好气性纤维素分解细菌的生长。 |
厌气性纤维素分解菌 | 嫌气性纤维素分解细菌培养基 | 0-1―10-5 | 3 | 14-21 | 根据各试管中滤纸条上有无穿洞、破裂、完全分解情况，确定有无嫌气性纤维素分解细菌的生长。 |
硫化细菌 | 硫化细菌培养基 | 0-2―10-8 | 3 | 21-23 | 在每管培养液中加入10g/L的BaCL2溶液2滴，如有白色沉淀出现，则证明有硫化菌活动。 |
反硫化细菌 | 斯塔克反硫化细菌培养基 | 0-2―10-7 | 3 | 21-30 | 根据培养液试管底部、管壁有无黑色沉淀出现，判断有无反硫化细菌活动。 |
