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微生物基本技术操作要求!
2018-05-23 15:28  点击:2081
一、无菌操作要求

微生物实验室工作人员,必须有严格的无菌观念,许多实验要求在无菌的条件下进行,主要原因,一是防止试验操作中人为污染样品,二是保证工作人员安全,防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。要求如下:

1.1接种细菌时必须穿工作服、带工作帽;

1.2进行接种食品样品时,必须穿专用的工作服、帽及拖鞋,应放在无菌室缓冲间,工作前经紫外线消毒后使用;

1.3接种食品样品时,应在进无菌室前用肥皂洗手,然后用酒精棉球将手擦干净;

1.4进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌,打开包装未使用完的器皿,不能放置后再使用,金属用具应高压灭菌或用酒精点燃烧灼三次后使用;

1.5从包装中取出吸管时,吸管尖部不能触及试管或平皿边;

1.6接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作,接种细菌活样品时,吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒;

1.7接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝,必要时还要烧到针和环与杆的连接处,接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min,再经火焰烧灼;

1.8吸管吸取菌液或样品时,应用相应的橡皮头吸取,不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

2.1 无菌间应密封,不得随意打开,并设有与无菌间大小相应的缓冲间及门,另尽量设有的小窗,以备进入无菌间后传递物品。

2.2无菌间应保持清洁,工作后用煤酚皂液溶液消毒,擦拭工作台面,不得存放与试验无关的物品;

2.3无菌间使用前后应将门关紧,打开紫外灯,如采用室内悬掉紫外灯消毒时,需30W紫外灯,距离工作台1m处,照射时间不少于30分钟,使用紫外灯,应注意不得直接在紫外线下操作,以免引起损伤,灯管每隔两周需用酒精球轻轻擦拭,除去上面的灰尘和油垢,以减少紫外线穿透的影响;

2.4处理和接种食品标本时,进入无菌间操作,不得随意出入,如需要传递物品,可通过小窗传递;

2.5在无菌间需用安装空调时,则应有过滤装置。

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等,必须经灭菌后方能使用。

3.1灭菌前准备
3.1.1所有需经灭菌的物品首先要清洗晾干,玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密,如用金属筒应将上面气孔打开。
3.1.2装培养基的三角瓶塞好棉塞,用纸包好,试管盖好盖,注射器须将管芯抽出,用纱布包好。

3.2装放
3.2.1大型高压蒸气锅:放置灭菌物品不应超过锅内容积的80%,物品应放置锅内搁架上或铁丝筐中。
3.2.2手提式高压锅:将物品分别包扎好,直接放入消毒筒内,物品之间不能过挤。

3.3设备检查
3.3.1检查门的开关是否灵活,橡皮圈有无损坏,是否平整。
3.3.2压力表蒸气排尽时是否停留在零位,关好门和盖,通蒸气或加热后,观察是否漏气,压力表与温度计所标示的状况是否吻合,管道有无堵塞。
3.3.3对有自动电子程序控制装置的灭菌器,使用前应检查规定的程序,是否符合于进行灭菌处理的要求。

3.4灭菌处理
手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行:
3.4.1手提式高压锅在主体内加入3L清水,立式高压锅加水16L(重复使用时应将水量补足,水变混浊需要更换)。
3.4.2手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中(无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用)。
3.4.3盖好顶盖拧紧,勿使漏气;置灭菌器于火源上加热,立式压力锅通上电源,并打开顶盖上的排气阀放出冷气(水沸腾后排气10~15min)。
3.4.4关闭排气阀,使蒸气压上升到规定要求,并维持规定时间(按灭菌物品性质与有关情况而定)。
3.4.5达到规定时间后,对需干燥的物品,立即打开排气阀排出蒸汽,待压力恢复到零时,自然冷却至60℃后开盖取物,如为液体物品,不要打开排气阀,而应立即将锅去除热源,待自然冷却,压力恢复至零,温度降到60℃以下再打开盖取物,以防止突然减压液体剧烈沸腾活容器爆破。

3.5灭菌温度与时间
3.5.1压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间见下表:

3.5.3取出的物品掉落在地或误放不洁之处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。3.5.2灭菌处理:灭菌后物品,剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。
3.5.4取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。
3.5.5凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。
3.5.6每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

四、有毒有菌污物处理要求

微生物实验室所用实验器材、培养物等未经消毒处理,一律不得带出实验室。
4.1经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内,并集中存放在指定地点,待统一进行高压灭菌。

4.2经微生物污染的培养物,必须经121℃,30min高压灭菌。

4.3染菌后的吸管,使用后放入5%煤酚皂溶液或石炭酸溶液中,最少浸泡24小时,再经121℃,30min高压灭菌。

4.4涂片染色冲洗片的液体,一般可直接冲入下水道,染色的玻片放入5%煤酚皂液中浸泡24h后,煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿,必须经高压灭菌后洗涤。

4.5打碎的培养物,立即用5%煤酚皂液或石炭酸喷洒和浸泡被污染部位,浸泡半小时后再擦拭干净。

4.6污染的工作服或进行烈性菌试验所穿的工作服、帽、口罩等,应放入专用消毒袋内,经高压灭菌后方能洗涤。

五、玻璃器皿的清洗要求

5.1目的
为了保证微生物实验顺利进行,保证实验结果的准确性,不影响实验进度,必须把器皿彻底清洗干净。

5.2注意事项
5.2.1任何洗涤方法,都不应对玻璃器皿有所损伤,不能用有腐蚀作用的化学药剂,也不能使用比玻璃器皿硬度大的物品来擦拭玻璃器皿。
5.2.2一般新的玻璃器皿用2%的盐酸液浸泡数小时,后用水冲洗干净。
5.2.3用过的器皿应立即洗涤,放置太久会增加洗涤困难。
5.2.4强酸、强碱及其它氧化物和有挥发性的有毒物品,都不能倒在洗涤槽内,以免污染环境水质,必须倒在废水缸中。
5.2.5含有对人体有传染性病菌的器具,应先煮沸灭菌后再进行洗涤。
5.2.6难洗涤的器皿不要与易洗涤的器皿放在一起,以免增加洗涤的麻烦。有油的器皿不要与无油的器皿混在一起,否则使本来无油的器皿沾上了油垢,浪费药剂和时间。

5.3洗涤剂的种类:
水、洗衣粉、柠檬洗涤剂、肥皂

5.4洗涤方法
5.4.1含有琼脂培养基的玻璃器皿的洗涤方法:事先应将器皿中的琼脂刮去,然后用清水洗涤,并用试管刷刷其瓶壁,以除去粘污在壁上的灰尘和油垢。用洗衣粉水洗去油污,然后用自来水冲洗。洗好后的器皿应倒置晾干或置于干燥箱中干燥至无水滴。
5.4.2载玻片及盖玻片的洗涤法:新载玻片及盖玻片先在20%的盐酸溶液中浸一小时,然后用自来水冲洗2~3次,最后用蒸馏水换洗2~3次。用过的载玻片及盖玻片,应用纸擦去油垢,再放在5%的洗衣粉水中煮30分钟后立即用自来水冲洗,然后放在稀的洗液中浸泡2小时,再用自来水冲洗至中性。
5.4.3移液管、倒管的洗涤方法:新的移液管及倒管先在的5%盐酸溶液中浸一小时,然后用自来水冲洗几次,最后用蒸馏水换洗几次。用过的移液管、倒管先用自来水洗去表面的残液,再放在洗衣粉水中浸泡一小时以上,再用自来水冲洗至管内壁无残渣,最后用蒸馏水换洗次,晾干后入恒温干燥箱中烘干。

六、培养基、无菌水的制备

6.1基本原理
培养基的种类很多,不同微生物所需要的培养基不同。培养基制成后的物理状态可分为液体、固体、半固体三种类型。

6.2器材
三角瓶、试管、烧杯、玻棒、天平、搪瓷杯、量筒、铝箔纸、角匙、杜氏小管、硅胶塞、电炉

6.3培养基的种类
营养琼脂培养基、乳糖胆盐发酵培养基、乳糖发酵培养基、伊红美兰琼脂培养基、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(附加抗菌素)、平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白冻肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤、EC肉汤、高盐察氏琼脂、三糖铁琼脂等

6.4方法步骤
6.4.1培养基的制备:
6.4.2称量:根据培养基的配方,称取适量药品于搪瓷杯中;
6.4.3溶解:用量筒量取所需水量,置电炉上加热,一边搅拌,至完全溶解,加热至沸腾,拔掉电源,待冷却;
6.4.4分装:根据不同需要,立即趁热分装入三角瓶或试管中,分装三角瓶以不超过三角瓶一半为宜,分装试管一般为管长的1/5(需根据试管的大小而定)。液体培养基如乳糖胆盐发酵培养基约分装10毫升左右。
6.4.5塞硅胶塞:装好培养基的试管应塞上硅胶塞,松紧合适,紧贴管壁,不留缝隙,约1/2塞入内,这样即可过滤空气,避免杂菌侵入,又可减缓培养基水分的蒸发。
6.4.6包装:三角瓶棉塞头部应用锡箔纸包扎,试管集中于试管篓。

6.5无菌水的制备:
6.5.1用10ml移液管量取9.2ml蒸馏水(稀释水)装入试管中。
6.5.2用100ml量筒量取95ml蒸馏水(稀释水)装入150ml的三角瓶中。可置少许玻璃珠于三角瓶内,防止暴沸。
6.5.3量取240ml蒸馏水(稀释水)于250ml的三角瓶中,塞上瓶塞用牛皮纸包扎好,高压灭菌备用。

七、设备使用原则

7.1实验设备的使用由实验员严格按照操作说明书进行,其他人员不得随意操作。

7.2实验设备的日常维护保养由实验员根据设备操作说明书进行,出现不可排除的故障时,经部门总经理批准,商请专业人员维修。

7.3实验设备应定期进行计量检测,确保仪器的准确性。

7.4实验员应爱护仪器设备,使用前应检查,使用后应及时清理清洁,并定期维护保养,下班前应检查设备电源是否关闭。
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