1.准备工作与材料：
菌种： 选取目标微生物（细菌、酵母等常用），确保其为纯培养物且处于对数生长后期（此时细胞活力强、耐受性好）。
培养基： 选择适合该菌种的液体培养基（如LB肉汤、YPD液体培养基等）。
保护剂：无菌甘油溶液（常用终浓度15%-30%，推荐50%或60%甘油母液）。
容器：无菌冻存管，要求能耐受超低温。
仪器耗材： 超净工作台、恒温摇床/培养箱、涡旋振荡器、无菌移液器及吸头、冰盒、记号笔。
低温设备：-80℃超低温冰箱（首选）或液氮罐。
2.菌体培养与收集：
在无菌条件下，将目标菌种接种到适量（如5-10ml）液体培养基中。
置于适宜温度下振荡培养（或静置培养，视菌种而定），直至达到对数生长后期（OD值监测或根据经验判断，通常培养过夜后）。
关键点： 避免培养过度进入衰亡期。
3.配制无菌甘油溶液：
通常使用50% (v/v) 或 60% (v/v) 的甘油水溶液作为母液。
将分析纯甘油与蒸馏水按比例混合（如50ml甘油 + 50ml 蒸馏水配成50%甘油）。
严格灭菌： 将配好的甘油溶液分装于合适容器（如带螺帽试管），高压蒸汽灭菌（121℃，15-20分钟）。冷却后备用。灭菌后务必混匀一次，防止分层。
4.菌悬液制备与混合甘油：
若使用50%甘油母液：混合比例为 1体积母液 : 2.33体积菌悬液 (即 0.3ml甘油母液 + 0.7ml菌悬液)。
若使用60%甘油母液：混合比例为 1体积母液 : 3体积菌悬液 (即 0.25ml甘油母液 + 0.75ml菌悬液)。
直接法（常用）： 离心（如4000 rpm, 10分钟）收集菌体，弃上清。用适量（如原培养液体积的1/2）新鲜无菌培养基或无菌生理盐水（0.85% NaCl） 重悬菌体，制成浓菌悬液。
间接法（操作更简单）： 直接吸取适量对数后期的新鲜菌液（无需离心）。
在无菌条件下（超净台内操作），将培养好的菌液转移至无菌离心管中。
根据实验需要，可选择：
取等体积的无菌甘油母液（50%或60%）与上述制备好的浓菌悬液或新鲜菌液在无菌冻存管中混合。
计算示例（终浓度15%甘油）：
使用涡旋振荡器或反复吹打，确保菌体与甘油充分、均匀混合。最终混合物应呈现均一、轻微浑浊状态。
5.分装与标记：
菌种名称（全称或标准缩写）
菌株编号（如有）
保存日期（年月日）
操作者姓名/缩写
甘油终浓度（可选，但推荐）
将混合好的菌液-甘油悬液，分装到预冷的无菌冻存管中。推荐体积： 0.5ml - 1.0ml（体积过小易干涸，过大冷冻/融化速度不均）。
立即、清晰、牢固地标记冻存管：
重要： 使用耐低温、防水的记号笔或标签纸（专用低温标签）。
6.预冷与冷冻：
将预冷后的冻存管迅速转移至 -80℃超低温冰箱 或投入 液氮气相（液氮罐液面之上）中保存。
目的：使样品快速通过冰晶形成最危险的温度区域（0℃至-40℃），减少大冰晶对细胞的损伤。
将分装标记好的冻存管置于冰盒中预冷10-15分钟。（此步可显著提高某些敏感菌的存活率）
快速冷冻（推荐，尤其对冷冻敏感的菌种）：
慢速冷冻（较少用）： 将冻存管放入程序降温盒中，再将盒子整体置于-80℃冰箱。盒内异丙醇能提供约-1℃/分钟的降温速率。适用于极少数对快速冷冻敏感的菌株（需验证）。
7.长期保存：
将冻存管稳定保存在 -80℃超低温冰箱 或 液氮罐（液相或气相） 中。-80℃保存最为常用便捷。
确保冰箱/液氮罐工作稳定，定期添加液氮或检查设备运行状态。
8.复苏（简要）：
需要使用时，从低温环境中快速取出目标冻存管（避免在室温停留过久导致冰晶融化损伤细胞）。
立即置于 37-42℃温水浴 中（或根据菌种最适生长温度调整），快速振荡融化（通常1-2分钟内完成）。
在无菌条件下，用移液器吸取适量融化的菌液（建议全部或大部分），接种到合适的固体或液体培养基上。
置于适宜条件下培养，检查菌种存活情况及纯度。
1.无菌操作是生命线： 整个操作过程（从菌液转移、甘油加入、分装到标记）必须在超净工作台内严格按照无菌操作规范进行。任何污染都将导致保存失败或菌种不纯。
2.菌龄至关重要： 务必使用对数生长后期的健康细胞。过早（活力不足）或过晚（细胞老化、自溶）都会显著降低复苏率。
3.甘油浓度需精确： 终浓度通常在 15%-30% 之间（常用15%-20%）。浓度过低保护不足，过高可能产生渗透压毒性或导致玻璃态转变温度升高不利于保护。务必使用无菌甘油溶液，并确保混合均匀。
4.冷冻速度的选择：快速冷冻（直接放-80℃）适用于绝大多数细菌和酵母，能有效减少冰晶损伤。仅对文献报道或经验证对快冻敏感的少数菌株考虑程序慢冻。
5.温度稳定性：-80℃超低温冰箱 是首选。避免使用普通 -20℃冰箱长期保存，此温度下冰晶仍会缓慢生长，导致细胞损伤，保存期大大缩短（通常仅数月）。
6.避免反复冻融： 冷冻保存的菌种严禁反复冻融。每次复苏后，该冻存管即应弃用。如需再次使用，应从保存的原始冻存管中取用，或复苏后重新制备新的甘油保存管。
7.清晰准确的标记： 模糊、脱落或信息不全的标签是实验室事故的常见根源。使用专用低温标签和记号笔，确保信息完整、永久清晰。
8.安全防护：
操作液氮时必须佩戴防冻手套（如厚皮手套或专用液氮手套）和护目镜，防止冻伤和溅射伤害。
使用-80℃冰箱存取样品时，也建议佩戴防冻手套，避免皮肤直接接触超低温金属表面。
9.复苏操作要快速： 融化过程务必快速（温水浴振荡），并立即将复苏菌种转移至适宜培养基中，减少甘油对细胞的潜在毒性作用。
10.定期检查与备份： 定期（如每年）复苏检查关键菌种的存活情况。对于极其重要的菌株，建议在不同设备或位置进行备份保存（如保存两管在不同冰箱/液氮罐），以防设备故障。
11.菌种特异性： 不同微生物对冷冻保存的耐受性不同。对于特殊或珍贵的菌株，建议查阅相关文献或进行预实验优化甘油浓度和冷冻条件。
12.冻存管质量： 确保使用高质量、密封良好、耐超低温的冻存管。劣质冻存管在低温下易破裂或密封失效，导致样品污染或干涸。
总结
甘油菌种冷冻保存法是一种高效可靠的微生物长期保藏技术。其成功的关键在于严格的无菌操作、使用对数期健康菌体、精确配制无菌甘油溶液、确保充分混匀、采用合适的冷冻速度（通常快速冷冻）、稳定保存在-80℃或更低温度、清晰的标记以及避免反复冻融。熟练掌握操作步骤并严格遵守注意事项，能最大程度地保证微生物菌种的活力、纯度和遗传稳定性，为科研、教学和产业应用提供宝贵的生物资源库。在操作中务必时刻牢记生物安全规范和个人防护，确保实验过程安全顺利。
