16、 PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？
答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。
17 、Western Blot内参选择什么合适？
答：这与目标抗原的表达位置有关，对于胞浆和全细胞蛋白，可选择内参β-actin、GAPDH和Tubulin；线粒体蛋白则可选择内参VCDA1/Porin和COXIV；核内抗原可以选择内参Lamin B1、TBP和histone。
18、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低？
答：转移缓冲液中加入20% 甲醇（终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也能增加转移效率；使用戊er醛交联；降低凝胶浓度，如低至6-7%或提高转膜电压/电流，增加转移时间。
19、转膜时凝胶肿胀或卷曲？
答：可将凝胶在转膜前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min。
20、跑胶的条带歪斜或者漂移？
答：电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致，可更换或者在两块海绵之间垫上少许普通的草纸。
21、转膜后膜上有单个或多个白点？
答：转膜时确保膜和胶块之间没有气泡。
22、转膜缓冲液过热？
答：缓冲液中离子浓度太低，电流或者电压过高，转膜过程中注意降温。
23、显影后胶片背景太高？
答：转膜前PVDF膜没有用100%甲醇全浸湿；洗膜不充分，可以增加膜洗涤次数；封闭不全，选择合适的封闭液和提高封闭时间；二抗浓度过高，降低二抗浓度；一抗特异性不强，换用特异性较强的单克隆抗体；曝光时间过长，减少曝光时间。
24、结果没有条带或者条带很浅，杂交信号很弱？
答：样品中不含靶蛋白或者含量太低，可增加蛋白上样量，设置已知标准量蛋白的对照；抗体稀释比例太低，孵育时间不够；转膜不好，转膜后可先用丽春红染色观看染色效果；曝光时间过短，增加曝光时间；抗体保存不当，效价降低。
25、目的条带位置偏低或者偏高？
答：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶，小分子蛋白要用高浓度胶。
26、有非特异性条带？
答：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带；一抗特异性不好，换用特异性较好的单克隆抗体；二抗非特异性引起的结果，可设立一组不加一抗只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异性结合；样品蛋白质可能降解，提取蛋白时注意冰上操作，加入适当的蛋白酶抑制剂，避免样品反复冻融；抗体浓度过高，降低一抗和二抗的浓度。
27、胶片是一片空白，是怎么回事？
答：如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。二抗的HRP活性太强，将底物消耗光；ECM底物中H2O2，不稳定，失活；ECL底物没覆盖到相应位置；二抗失活。
28、目的条带是白色，周围有背景？
答：目的蛋白含量太高；一抗浓度偏高，二抗上HRP催化活力太强。
Western blot常见问题及注意事项（二）
2024-11-14 来源：上海抚实实业
