一、概要

用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫方法结合了色谱技术，采用AHD衍生物的特异性抗体，具有很高的精确度和灵敏度，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点在检测中很好的表现出来。



二、试验原理

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物的AHD经衍生化后和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物AHD代谢物的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呋喃妥因代谢物的残留量。



三、适用范围

 可定性、定量检测动物组织（鸡、猪、牛、鱼、虾等）、牛奶和蜂蜜中呋喃妥因代谢物的残留量。



四、交叉反应率

呋喃妥因代谢物…………………………………………100%

呋喃唑酮代谢物…………………………………小于0.1%

呋喃它酮代谢物…………………………………小于0.1%

硝基糠腙（呋喃西林）代谢物…………………小于0.1%

呋喃唑酮………………………………………………小于1%

呋喃它酮………………………………………………小于1%

呋喃妥因………………………………………………13%

呋喃西林…………………………………………小于1%



五、使用单位需自备的设备及试剂

设备：

┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm

┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置

┅┅均质器

┅┅振荡器

┅┅涡旋仪

┅┅离心机

┅┅天平：感量0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶：100ml、1L

┅┅玻璃试管：10ml

┅┅聚苯乙烯离心管：50ml

┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、100ml～1000ml

多道 250ml

试剂：

┅┅乙酸乙酯(分析纯)

┅┅正己烷（或正庚烷）(分析纯)

┅┅三水合磷酸氢二钾(分析纯)

┅┅甲醇(分析纯)

┅┅二水合亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）（分析纯）（供奶样用）

┅┅七水合硫酸锌(ZnSO4·7 H2O) (分析纯)（供奶样用）

┅┅浓盐酸

┅┅氢氧化钠(分析纯)

┅┅去离子水



六、提供的材料与试剂

1、96孔酶标板×1块 （包被有偶联抗原）

2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）

0ppb，0.1ppb，0.3ppb，0.9ppb，2.7ppb，8.1ppb

3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 100ppb

4、酶标二抗         12ml …………………… 红色帽

5、抗体工作液       7ml …………………… 绿色帽

6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽

7、底物液 B 液       7ml …………………… 红色帽

8、终 止 液          7ml …………………… 黄色帽

9、20×浓缩洗涤液     40ml……………………… 透明帽

10、2×浓缩复溶液      50ml……………………… 蓝色帽

11、2-硝基苯甲醛      15.1mg…………………… 黑色帽



七、溶液的配制

配液1: 衍生化试剂

          向装有2-硝基苯甲醛的试剂瓶中加甲醇溶解定容至10ml（浓度为10mM）。

配液2: C液（供奶样用）：

0.36M亚硝基铁氰化钠（Na2Fe(CN)5·NO·2H2O）溶液

             称取12.5g 二水合亚硝基铁氰化钠加去离子水定容至100ml

      D液（供奶样专用）：

1M硫酸锌（ZnSO4·7H2O）溶液

             称取29.8g 硫酸锌用去离子水定容至100ml

配液3: 0.1M 磷酸氢二钾溶液

           称取22.8g 三水合磷酸氢二钾加去离子水定容至1L。

配液4: 1M盐酸溶液     

           量取8.3ml浓盐酸加去离子水定容至100ml。

配液5: 1M氢氧化钠    

           称取4.0g氢氧化钠加去离子水定容至100ml。

配液6: 甲醇-水溶液

          量取甲醇90 ml加去离子水10 ml混匀。

配液7: 复溶工作液

用去离子水将2×浓缩复溶液按1：1体积比进行稀释（1份2×浓缩复溶液+1份去离子水）用于提取样本的复溶，复溶工作液在4℃环境可保存一个月。

配液8: 洗涤工作液

用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。



八、样本前处理步骤

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

   （b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果

（c）衍生化试剂可于2-8℃保存半年。

（d）未处理的样本冷冻保存。

（e）处理好的样本可在2-8℃避光保存24小时。

 （一）肌肉、肝脏、水产（鱼虾等）组织前处理方法

┅┅用均质器均质样本

┅┅取1.0±0.05g的均质物至50ml聚苯乙烯离心管中；

┅┅加入5ml甲醇-水溶液（见配液6），用振荡器振荡5min，3000g以上离心10min，去除全部上清液；（本步骤可降低样本基质干扰）

┅┅加入4ml的去离子水，用涡旋仪涡动溶解，加入0.5ml 1M 盐酸溶液（见配液4）和100ml 衍生化试剂（见配液1），用振荡器充分振荡；

┅┅接（四）描述方法（标 * 处）。

注：样本应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存

 （二）牛奶前处理方法

┅┅取牛奶样本，3000g以上，10℃离心10min，吸除上层脂肪；

┅┅取出5ml去除脂肪牛奶样本至10ml玻璃离心管中；

┅┅分别加入250ml C液和250ml D液（见配液2）；

┅┅用振荡器充分振荡混合，3000g以上，4~12 oC（39-54H）离心10min。如果没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8 oC（46H），然后离心；

┅┅取牛奶的离心上清液1.1 ml（相当于1 ml奶样），分别加入4ml的去离子水用振荡器振荡溶解，0.5ml 1M 盐酸（见配液4）和100ml 衍生化试剂（见配液1），充分振荡2min；

┅┅接（四）描述方法（标 * 处）。

（三）蜂蜜前处理方法

┅┅称取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯离心管中；

┅┅加入4ml的去离子水，用振荡器振荡至蜂蜜全部溶解；

┅┅0.5ml 1M 盐酸溶液（见配液4）和100ml 衍生化试剂（见配液1），用振荡器充分振荡；

┅┅接（四）描述方法（标 * 处）。

（四）接上面的方法

*┅┅在37 oC过夜孵育（大约16h）；

┅┅分别加入5ml 0.1M磷酸氢二钾溶液（见配液6）、0.4ml 1M氢氧化钠溶液（见配液5）和5ml的乙酸乙酯，用振荡器剧烈振荡30s；

┅┅3000g以上，室温（20-25 oC/68-77H）离心10min；

┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃试管中，于50～60℃氮气流下吹干；

┅┅用1ml的正己烷（或正庚烷）用涡旋仪涡动30s，再加入1ml复溶工作液（见配液7），用涡旋仪涡动1min充分混匀；

┅┅3000g以上，室温（20-25 oC/68-77H）离心10min；

┅┅除去上层有机相，取下层水相50µl用于分析。



九、检测步骤

测定前应须知：

1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。

操作步骤：

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗涤工作液在使用前也需回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本：加入标准品/样本50ml 到对应的微孔中，然后加入抗体工作液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液8）250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

7、加酶标二抗：加入酶标二抗100ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。

8、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应15min（见注意事项8）。

9、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。



十、结果判定

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与呋喃妥因代谢物的含量成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。例如样本1的吸光度值为0.236，样本2的吸光度值为0.666，标准品吸光度值分别是： 0ppb为1.949；0.1ppb为1.434； 0.3ppb为.939； 0.9ppb为0.487； 2.7ppb为0.157； 8.1ppb为0.060。则样本1的浓度范围是0.9ppb-2.7ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呋喃妥因代谢物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0.3ppb-0.9ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中呋喃妥因代谢物残留的浓度范围。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝ B ×100%

 B0 

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋喃妥因代谢物标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋喃妥因代谢物的实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

样本稀释倍数

鱼虾和肌肉肝脏样品稀释倍数：2

奶样样品稀释倍数：2

蜂蜜样品稀释倍数：2



十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度：0.1ppb

样本最低检测限：

组织、蜂蜜，牛奶样品检测下限………………………0.2ppb

虾\鱼等水产组织因存在一定的干扰，检测下限在0.3ppb

准确度：

水产、肌肉、肝脏组织 ……………………………  75±15%        

蜂蜜样本 …………………………………………  90±15%

奶样………………………………………………  90±10%

精密度：

试剂盒的变异系数均小于10%



十二、注意事项

1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需要将其摇匀。

4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件

保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象

发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。

9、该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。



十三、贮藏条件及保存期

     贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃。

保存期：该产品有效期为12个月。



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