（针对中国猪蓝耳病变异株检测）

一，产品简介

一步法突变型猪生殖与呼吸综合症病毒反转录PCR

检测临床样本和环境样本

包括48 个扩增反应所需的试剂48次/盒

请在使用前通读操作手册

二. 试剂盒组成

￭ 25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4oC 保存)

￭ 2 x 520 μl PRRSV 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20oC 保存)

￭ 2 x 25 μl 阳性对照 (Positive control; -20oC 保存)

三，保存条件

试剂球需置干燥剂中保存在4oC，已融解的试剂球则需保存在零下20oC。其它试剂亦需保存在零下20oC。使用前在冰上溶解各试剂并充分混合，不要旋涡振荡含酶的扩增反应试剂。

四. 操作程序

扩增反应试剂的准备

1. 计算所需的反应数量 (n)

2. 需要溶解的试剂球 = 0.5 x n

3. 每个试剂球需要 40 μl 试剂球溶液

4. 在冰上溶解试剂，并轻轻扣击充分混合 (不要旋涡振荡含酶的试剂)

反应的准备

1. 实验中除从样本中获得的RNA 模板外，我们还建议设置阳性和阴性（水）对照

2. 按照下表准备扩增反应试剂：

反应组分 每个反应体积

扩增反应试剂 20 μl

样品RNA 5 μl

总体积 25 μl

注意:

￭ 实验时 RNA 应放在冰上

￭ 阳性对照建议加5 μl 试剂盒提供的阳性对照。

￭ 建议PCR 过程中检测样本设置重复，以便得到可靠的实验结果

￭ 为了验证阴性实验结果不是由于样本中存有PCR 抑制物而导致PCR 呈阴性反应，我们建议在测试样本中加1 μl 的阳性对照作为spiking 对照 (spiking control)，同时进行PCR 反应。

PCR 循环:

1 个循环 42oC 30 分钟

95oC 10 分钟

40 个循环 95oC 30 秒

53oC 45 秒

72oC 30 秒

五. 实验数据分析

PCR 的产物需要通过2%琼脂糖凝胶电泳检测。野生型PCR 产物的长度为330 b.p.相对于变种型PCR 产物的长度为240 b.p.

Spiking 对照

阴性的实验结果有几个可能性：

1. 样本中不存在目的片段；

2. 样本中目的片段的量低于检测值；

3. 样本中存有 PCR 抑制物。试剂盒中设计spiking 对照 (spiking control) 是为了确定没有发生PCR 抑制。

如果样本中加了阳性对照以后得出阴性结果，说明样本中存在PCR 抑制物，那幺此次阴性的实验结果就不能作为正确的结果，需要重新开始样本核酸的提取和PCR 扩增。



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